En 1967 el biólogo molecular Sol Spiegelman creó un pequeño monstruo en su laboratorio de la universidad de Illinois. Los ingredientes añadidos para formarlo fueron pocos: una cadena de ARN de un virus (que al igual que el ADN guarda la información genética), nucleótidos libres (las letras que componen el ARN y ADN), una enzima capaz de duplicar ese ARN (llamada replicasa) y diferentes sales, todo mezclado en una disolución acuosa. El monstruo formado fue diminuto, podía replicarse y llevaba ya un tiempo evolucionando por su cuenta. Cuando Spiegelman añadió por primera vez el ARN del virus, que tenía unos 4.500 nucleótidos de longitud, éste empezó a duplicarse usando la replicasa. Pasadas 74 generaciones (o rondas de duplicación), la cadena de ARN pasó a tener solamente 218 nucleótidos, es decir, que había eliminado el 83% de su longitud original. A este pequeño ARN se le llamó posteriormente el Monstruo de Spiegelman. ¿Pero qué había pasado durante todas aquellas generaciones para que el ARN tomara su propio camino evolutivo acortándose tanto? La base se encuentra en el azar y en la replicasa, que tiene ciertas probabilidades de fallar al duplicar las cadenas de ARN. Lo que había ocurrido era simplemente evolución darwiniana, o «reproducción del más apto». Bajo aquellas circunstancias (una disolución sin nada más que el ARN y la enzima encargada de duplicarlo), la selección natural favoreció aquellas variantes de ARN más cortas, ya que su tiempo de duplicación es menor. Para entender el proceso imaginemos el proceso, por ejemplo, en la primera ronda o generación: todas las cadenas de ARN iniciales se duplicaron, pero algunas tendrían variaciones. Aquellos ARN que fueran un poco más cortos que el resto tardaron menos tiempo en duplicarse, por lo que sus hijos aparecerían antes en la segunda generación. La segunda ronda de duplicación estaría pues adelantada para estos ARN hijos más cortos, por lo que se duplicarían antes que el resto. A su vez, los ARN más cortos de la segunda generación se duplicarían más rápido y aparecerían antes en la tercera generación. Y así sucesivamente hasta la generación 74 en la que terminó el experimento, en la cual el ARN más común era el Monstruo de Spiegelman, de 218 nucleótidos de longitud.
Sin saberlo, Spiegelman había asentado las bases de la evolución dirigida, que no es más que la evolución darwiniana encerrada en un laboratorio (el término dirigido no es más que un mero adjetivo para denotar nuestro ego). La evolución dirigida no solo es aplicable al ARN, también al ADN y a las proteínas; en realidad, a cualquier sistema darwiniano donde exista variabilidad y heredabilidad, es decir, sistemas donde todas las individualidades no sean iguales y sus identidades sean heredadas a la siguiente generación. Durante las siguientes décadas al descubrimiento del Monstruo de Spiegelman, las técnicas moleculares para obtener una evolución dirigida eficaz se han ido perfeccionando a la vez que se usaban diferentes moléculas (proteínas, enzimas, ADN, etc), hasta el punto en el que hoy día la evolución dirigida se usa en multitud de industrias para obtener y sintetizar fármacos o enzimas. Este proceso es realmente valioso en la actualidad, tanto que en 2018 el premio Nobel en Química le fue concedido a la ingeniera química Frances Hamilton Arnold por sus avances en la evolución dirigida de enzimas con aplicación industrial (junto a George Smith y Gregory Winter, los tres representados en la imagen de portada).
¿Pero qué es exactamente la evolución dirigida y por qué es tan importante? Como hemos mencionado en el párrafo anterior, la evolución dirigida imita la evolución darwiniana en un entorno cerrado y controlado. El objetivo del proceso es obtener una molécula, ya sea una proteína o un gen, que tenga una función distinta de la original y que nos sea útil para nuestro proceso de interés. En el caso del Monstruo de Spiegelman la función u objetivo al que se quería llegar no existía, era simplemente un experimento para saciar nuestra curiosidad. Pero actualmente la evolución dirigida necesita de un objetivo, de ahí el significado del nombre “evolución dirigida”: nosotros seleccionamos las variantes que nos son útiles y desechamos el resto, dirigimos la evolución. De hecho, si profundizamos en el significado del concepto nos daremos cuenta de que este proceso ya estaba en cierta medida descrito: es la selección artificial de Darwin pero aplicada a las biomoléculas. Uno de los objetivos más habituales de la evolución dirigida es mejorar la eficiencia de las enzimas a la hora de unir moléculas y producir productos más complejos en diversos medios y a diferentes condiciones de temperatura y presión. En la industria esto ahorra energía (las enzimas evolucionadas funcionan mejor a menores temperaturas), materia prima (las enzimas evolucionadas requieren menor cantidad de sustrato, o cantidad de moléculas) y, consecuentemente, dinero. Otro de los objetivos de la evolución dirigida es el desarrollo de proteínas o fármacos con funciones nuevas o mejoradas, desarrollados bajo el marco de la ingeniería de proteínas, una rama científica que se encarga de crear y mejorar proteínas usando diferentes técnicas entre las cuales se halla la evolución dirigida.
Como la evolución dirigida no es más que la evolución darwiniana a pequeña escala, requiere de las mismas tres fuentes que la evolución clásica (darwniana) para funcionar: variabilidad entre las individualidades (o proteínas), que esa variación cause diferencias en el funcionamiento de la proteína y que esa variación se herede. Todos estos principios se cumplen en la evolución dirigida. De hecho, nosotros provocamos y controlamos estos tres principios en el laboratorio, cada uno constituyendo una fase del proceso de la evolución dirigida. Para obtener, por ejemplo, una enzima evolucionada necesitamos: (1) crear variabilidad, que se logra mutando la secuencia de ADN del gen que codifica para dicha enzima; (2) comprobar que esas mutaciones en el ADN se traducen en cambios en la estructura tridimensional y optimización de la enzima, seleccionando las variantes que nos son favorables; y (3) trasmitir esas mutaciones seleccionadas a la siguiente generación, que se logra mediante la técnica molecular PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction), que explicaremos brevemente más adelante. Estas tres fases se repiten las veces que se hagan necesarias hasta obtener finalmente la enzima que deseamos. Vamos a explicar cada una de las fases para entender mejor el proceso.
1. Creación de variabilidad
Ya hemos dicho que la obtención de variabilidad del gen que codifica para una proteína se logra mutando la secuencia de ADN de dicho gen. Las mutaciones que creamos en la secuencia del gen se traducen en un cambio en la estructura y función de la proteína, ya que los cambios en el ADN se traducen en cambios en la composición de la proteína a la que da lugar. Para mutar las secuencias de ADN existen multitud de técnicas y aproximaciones, pero mencionaremos solo algunas. La mutagénesis, nombre con el que se denomina la creación de mutaciones en el ADN, puede lograrse, por ejemplo, usando productos químicos que induzcan la aparición de mutaciones. Otra opción es recurrir a ciertas bacterias que son capaces de mutar secuencias de ADN con mayor probabilidad que el resto de bacterias. Es el caso de las cepas mutadoras de la bacteria Escherichia coli, modificadas genéticamente para que no posean ningún mecanismo capaz de reparar su ADN. De esta manera podemos introducir nuestro gen en el ADN de la bacteria E. coli mutadora para que, conforme se vaya reproduciendo (o lo que es lo mismo, duplicando su ADN), las mutaciones que surjan espontáneamente se vayan acumulando, ya que no podrán repararse. Por último, otra técnica plausible para obtener variabilidad en la secuencia de ADN de nuestro gen es el uso de la PCR propensa al error. Resumidamente, la PCR normal es una técnica molecular que consiste en la obtención de millones de copias de una secuencia de ADN, es decir, de nuestro gen. Para lograrlo, la PCR imita el proceso de replicación o duplicación del ADN que se da en la propia célula pero en una disolución hecha en el laboratorio y a unas temperaturas concretas. Esta disolución contiene prácticamente los mismos ingredientes que la disolución que hizo Spiegelman para crear su monstruo (si quieres saber exactamente cómo se replica el ADN mediante PCR, haz click aquí). Con saber que la PCR nos sirve para generar millones de copias del ADN del que partimos nos vale para la finalidad de este artículo. La PCR propensa al error no es más que una variación de la PCR normal que, como bien indica su nombre, tiene más probabilidades de fallar a la hora de replicar el ADN. La finalidad de las tres técnicas expuestas (químicos, bacterias mutadoras y PCR propensa al error) es simplemente la de generar variabilidad creando mutaciones o fallos en nuestro gen.
2. Detección de la variabilidad
Una vez tenemos las miles de secuencias mutadas de nuestro gen, tenemos que detectar dichas mutaciones. Este proceso se denomina cribado de secuencias. El cribado no es más que la detección de aquellas variantes del gen que nos son de interés, desechando el resto. Para ello, cada variante de nuestro gen que obtuvimos en el paso anterior es introducida en el ADN de bacterias, por lo que cada bacteria poseerá una variante del gen en su ADN. De esta manera, las bacterias son cultivadas en el laboratorio, concretamente en placas con los nutrientes necesarios para que crezcan y se reproduzcan. Como la reproducción de las bacterias es exponencial (de una salen dos; de las dos, cuatro; de las cuatro, ocho, etc), tendremos millones de copias de las variedades de nuestro gen la cabo de unas horas y, por ende, millones de copias de las variedades de la proteína a la que dan lugar. Aquí es donde interviene el cribado: debemos seleccionar solo las variedades que nos son útiles. Para lograrlo se utilizan diferentes moléculas, muy específicas, capaces de unirse fuertemente solo a las variantes de las proteínas que queremos. Cuando esta molécula se une a nuestra proteína, o bien emite fluorescencia que podemos captar con diferentes aparatos o bien cambia el color del medio de cultivo de las bacterias. De esta manera, solo nos queda aislar dicha variante y prepararla para la tercera y siguiente fase.
3. Herencia de la variabilidad
Como último paso, solo nos queda asegurarnos de que la variante de interés sea heredada por la siguiente generación, es decir, transmitirla a la descendencia para que siga perpetuándose. Esto en la naturaleza se consigue con la reproducción, pero en la evolución dirigida se consigue con la técnica PCR (que es capaz de producir millones de copias de un gen o, lo que es lo mismo, millones de hijos). Cuando conocemos la variante del gen que nos es de interés (identificada previamente por fluorescencia o cambio de color), hay que aislar las bacterias que dieron lugar a dicha variante y extraerles su ADN. Una vez extraído el ADN bacteriano, extraemos el gen de nuestra variante. Y una vez extraído dicho ADN, la copiamos millones de veces con la PCR. Al final del proceso tenemos nuestra variante del gen aislada y replicada en cantidades enormes.
Tras llegar a esta tercera y última fase, volveríamos de nuevo a la primera (esto sería un ciclo, o una generación en el Monstruo de Spiegelman). Es decir, que la variante la volveríamos a mutar, identificaríamos las nuevas variaciones creadas, aislaríamos la nueva variante más beneficiosa y la copiaríamos millones de veces. Y vuelta a empezar. Así hasta que consigamos la mayor optimización y funcionalidad de la proteína. En la industria farmacéutica o alimentaria significa una enzima evolucionada más productiva, más efectiva, más veloz o más eficiente, según el objetivo al que se quiera llegar. Para el monstruo significaba un menor tiempo de replicación.
Para finalizar este artículo, vamos a poner un ejemplo real donde se aplicó la evolución dirigida: el desarrollo de enzimas tolerantes a altas temperaturas, las termoenzimas. Una termoenzima es una enzima que funciona (forma un producto a partir de dos moléculas) a una temperatura tan alta que va desde los 60ºC hasta los 120ºC. Las termoenzimas son de elevada importancia en muchas industrias, ya que son resistentes a solventes orgánicos, a detergentes o a soluciones con pH alto o bajo. Las termoenzimas se desarrollaron a partir de variantes de enzimas normales que funcionan a temperaturas medias (25-40ºC). Las variantes se replicaron con una PCR propensa al error (fase 1), se introdujeron en el ADN de la bacteria Thermus thermophilus capaz de crecer a altas temperaturas, posteriormente se seleccionaron solo aquellas enzimas que no se degradaban a temperaturas cada vez mayores (fase 2) y se extrajo el ADN de aquellas bacterias T. thermophilus que daban lugar a las enzimas más resistentes al calor (fase 3). El resultado de repetir este proceso varias rondas fue la obtención de enzimas que resistían los 70ºC sin problemas y que eran perfectamente funcionales. Es decir, que de una enzima que funcionaba a unos 30ºC se consiguió conseguir otra optimizada que funcionaba a 70ºC, esencial para sintetizar esteroides en la industria farmacéutica. Cambiando las presiones selectivas y controlando la dirección de las variedades obtenidas por evolución darwiniana, podemos crear pequeños monstruos que satisfagan nuestras necesidades.
Referencias:
1. D. R. Mills, R. L. Peterson y Sol Spiegelman (1967). An extracelular darwinian experiment with a self-duplicating nucleic acid molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 58 (1), pp: 217-224.
2. Ryan E. Cobb, Ran Chao y Huimin Zhao (2013). Directed evolution: past, present and future. AlChE Journal, American Institute of Chemical Engineers, 59 (5), pp: 1432-1440.
3. Stefan Lutz (2010). Beyond directed evolution: semirational protein engineering and design. Current Opinion in Biotechnology, 21 (6), pp: 734-743.
4. Ana Luisa Ribeiro, Mercedes Sánchez, Aurelio Hidalgo y José Berenguer (2017). Stabilization of enzimes by using Thermophiles. En: Microbial steroids. Methods in molecular biology (editores: J. L. Barredo y I. Herráiz). Humana Press, Nueva York, volumen 1645.
5. Michael S. Packer y David R. Liu (2015). Methods for the directed evolution of proteins. Nature Reviews, 16 (1), pp: 379-394.
Recursos: La imagen de portada muestra a los tres premiados con el Nobel de Química en 2018, de izquierda a derecha: Frances H. Arnold, George P. Smith y Gregory P. Winter (ilustración de Niklas Elemehed, © Nobel Media AB 2018). La imagen del virus MS2 y su ARN se ha construido en base a la fotografía del virus de Jean Yves Sgro (extraída de virology.wisc.edu/virusworld) y la del ARN, extraída de Wikipedia. La fotografía del ciclo de evolución dirigida se ha extraído del artículo de Michael S. Packer y David R. Liu (2015).
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